為了*大限度地從纖維素中釋放葡萄糖，以便進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵或化學(xué)轉(zhuǎn)化，木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的預(yù)處理是先決條件。一種主要的預(yù)處理方法是在高溫（140 至 200 °C）下使用稀酸（例如 0.3 – 2% 的硫酸），并根據(jù)不同的保溫時間和生物質(zhì)/酸負(fù)載量進(jìn)行處理1。該工藝的缺點(diǎn)是木質(zhì)素（一種多酚大分子）會部分降解為較小的酚類物質(zhì)，這些酚類物質(zhì)會與糖類一起釋放到所謂的水解產(chǎn)物中。這些酚類化合物對微生物具有毒性，并且是潛在的發(fā)酵抑制劑2-5。

在優(yōu)化預(yù)處理或解 毒方法以*大程度降低抑制劑水平或培育更具抵抗力的微生物時，分析這種酚類化合物的譜圖至關(guān)重要。在廣泛使用的樣品制備和凈化步驟中，酚類化合物會使用有機(jī)溶劑（例如乙酸乙酯）進(jìn)行液-液萃取，然后通過氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用 (GC/MS) 進(jìn)行分析。

液液萃取雖然有效，但耗時較長，需要4次獨(dú)立萃取和多次離心步驟。為了減少時間和樣品處理步驟，我們采用了 Novum SLE 簡化液體萃取 (SLE) 技術(shù)，節(jié)省了大量時間，并減少了所需的移液和樣品瓶處理步驟。

材料和方法

采用兩種不同的方法制備木質(zhì)纖維素生物質(zhì)：傳統(tǒng)液-液萃取法和簡化液相萃取法 (SLE)，使用 Novum SLE MAX 96 孔板（部件號 8E-S138-5GA）。在每種萃取方法之前，樣品均按以下方式進(jìn)行預(yù)處理：

預(yù)處理：
將來自巨型芒草（Miscanthus X giganteus）的稀酸預(yù)處理水解液（1.5% 硫酸，190 °C 加熱 1 分鐘，25% 生物質(zhì)負(fù)載量）用 0.45 μm 聚醚砜 (PES) 濾膜過濾，并加入 20 μg/mL 異丙基苯酚作為內(nèi)標(biāo) (IS)。然后采用液-液萃取或單層萃取 (SLE) 法（見下文）對預(yù)處理后的樣品進(jìn)行萃取。

液-液萃取步驟：
取預(yù)處理步驟中加標(biāo)的水解產(chǎn)物1 mL，用0.5 mL乙酸乙酯萃取4次。每次萃取后，進(jìn)行離心（1500 g，1分鐘）以進(jìn)行相分離。合并各樣品的萃取液，用硫酸鈉6干燥（樣品A）。

簡化液相萃取 (SLE) 程序：
將預(yù)處理步驟中加標(biāo)的水解產(chǎn)物 400 μL 上樣至 Novum SLE MAX 96 孔板的孔中。樣品在吸附劑中浸泡 5 分鐘，然后用乙酸乙酯洗脫目標(biāo)分析物。采用三種不同體積來確定*有效的洗脫體積。使用短脈沖真空，分別加入 1x 0.4 mL（樣品 B）、1x 0.8 mL（樣品 C）或 2x 0.4 mL（樣品 D）乙酸乙酯。洗脫后無需進(jìn)一步干燥乙酸乙酯。GC/MS 條件：在進(jìn)行GC 分析之前，將 100 μL 提取物（樣品 A - D）與 50 μL BSTFA 在 70 °C 下孵育 30 分鐘，然后進(jìn)行 GC/MS6 分析。所有萃取均重復(fù)進(jìn)行三次，并按以下順序進(jìn)行重復(fù)（1-3）：樣品 A1 – D1，然后 A2 – D2，然后 A3 – D3，以避免由于運(yùn)行時間較長（67 分鐘）導(dǎo)致未處理樣品的成分發(fā)生變化而產(chǎn)生任何偏差。以不分流模式將 1 μL 注入 5 ms 毛細(xì)管氣相色譜柱（30 mx 0.25 mm x 0.25 μm）。

使用7890A 氣相色譜儀與 5975C 單四極桿質(zhì)譜儀聯(lián)用進(jìn)行分析，分析參數(shù)如下：進(jìn)樣口和傳輸線溫度 280 °C，載氣：氦氣，流速 1 mL/min，升溫程序：75 °C 恒溫 3 分鐘，以 5 °C/min 升至 150 °C，以 0.5 °C/min 升至 160 °C，以 2 °C/min 升至 190 °C，以 5 °C/min 升至 240 °C，以 70 °C/min 升至 325 °C，恒溫 3 分鐘。采用全掃描模式檢測 m/z 35-500 離子。

結(jié)果與討論
圖 1 顯示了使用 3 種洗脫程序（0.4 mL、0.8 mL 和 2x 0.4 mL）從 Novum SLE MAX 96 孔板洗脫的水解產(chǎn)物中 25 種選定的酚類化合物的相對回收率，與通過傳統(tǒng)液-液萃取獲得的值（代表圖上為 100%）相比。

總體而言，Novum SLE 萃取法的回收率與傳統(tǒng)液-液萃取法相當(dāng)，且所需時間僅為后者的一小部分（樣品制備時間減少了五倍）。0.4 mL 乙酸乙酯洗脫的分析物回收率普遍低于 0.8 mL 和 2x 0.4 mL 體積萃取法。例外情況是 4-羥基-3-甲氧基肉桂醛（圖 1，分析物 9），所有洗脫體積的回收率幾乎相同（分別為 95% 和 93%），而芥子醛（圖 1，分析物 12）在 0.4 mL 萃取體積下的回收率 (93%) 高于其他萃取體積（分別為 89% 和 85%）。然而，0.4 mL 萃取體積通常被認(rèn)為不是*佳選擇。將洗脫體積增加到 0.8 mL 可提高回收率，大多數(shù)回收率達(dá)到 90% 以上。 4-羥基苯甲醛 (87%)（圖 1，分析物 1）和香蘭素 (89%)（圖 1，分析物 2）的產(chǎn)量略低。只有同系物 2-愈創(chuàng)木酰乙醛（圖 1，分析物 14）和 2-丁香乙醛（圖 1，分析物 16）的回收率較低，分別為 75-76% 和 73-75%。將 0.8 mL 洗脫液分兩步（2x 0.4 mL）加入，與單次 0.8 mL 洗脫相比，回收率并未提高。TN-0082 第 2 頁，共 4 頁 應(yīng)用